Transfert et transport d'hème entre protéines et signalisation transmembranaire – HEMETRANS

Le projet proposé a pour but de comprendre à l'échelle moléculaire les modifications conformationnelles se produisant sur les éléments d'un complexe pluriprotéique associant une protéine extracellulaire et des protéines situées dans deux membranes distinctes. Ce complexe a une fonction de transport de l'hème à travers la membrane externe des bactéries gram-négatives et a également une fonction de signalisation transmembranaire. Dans la cellule ce complexe n'est pas permanent et sa dissociation dépend d'un apport d'énergie aux dépens de la force proton motrice. Ce projet associe quatre équipes, deux françaises (l'une spécialisée en génétique et physiologie bactériennes, biochimie, l'autre en biophysique, RMN, biochime) directement éligibles à l'ANR, une allemande spécialisée en cristallographie/dynamique moléculaire, enfin une américaine spécialisée en spectroscopie Raman. Ces quatre équipes collaborent depuis de nombreuses années. Une partie du projet a été déposée à la DFG qui, comme l'ANR, ne finance que les équipes nationales dans ce cadre. Les bactéries Gram-négatives dont l'enveloppe est constituée de deux membranes séparées par l'espace périplasmique possèdent des récepteurs de membrane externe appelés récepteurs TonB-dépendants. Leur rôle est de fixer et d'internaliser des cofacteurs peu concentrés et essentiels à la croissance, comme la vitamine B12 ou des chélates de fer (sidérophores, hème). L'internalisation du substrat dans le périplasme est un processus actif lié à la transduction de l'énergie de la force proton motrice (générée à la membrane interne) au récepteur, ce qui permet la translocation du substrat à travers le récepteur. Le complexe TonB contacte le récepteur au niveau d'une séquence appelée « boîte TonB » ; la transduction d'énergie provoque un changement conformationnel au sein du récepteur permettant l'entrée du substrat. Nous avons développé un système modèle composé d'un récepteur de membrane externe qui acquiert et transporte l'hème libre ou lié à une protéine bactérienne sécrétée appelée hémophore. L'hémophore grâce à sa très haute affinité pour l'hème acquiert l'hème des hémoprotéines et le délivre au récepteur, ce malgré une affinité relative du récepteur pour l'hème défavorable. Sous l'action du complexe TonB ou d'un complexe HasB analogue, spécifique du récepteur étudié, et de la force proton-motrice, l'hème est internalisé et l'hémophore dissocié du récepteur. Des structures à haute résolution sont disponibles pour l'hémophore et nous venons d'obtenir une structure à haute résolution du complexe hémophore-récepteur. Aucun récepteur bactérien à hème/hémoprotéine n'a été cristallisé à ce jour et nous pensons que le système que nous développons peut servir de modèle pour au moins trois aspects de ces phénomènes de transport(i-transfert d'hème de protéine à protéine induit par une interaction protéine-protéine, ii-signalisation transmembranaire, iii-dissociation induite par l'énergie d'un complexe très stable). Nous avons également obtenu les paramètres thermodynamiques des interactions se produisant entre les différents constituants de ce complexe. Au cours de ce projet nous souhaitons : i) tirer parti des informations structurales déjà à notre disposition pour obtenir, grâce à des mutants que nous construirons, des informations fonctionnelles sur ce système et valider ou infirmer des hypothèses que nous pouvons émettre sur la base de ces structures, ii) obtenir de nouvelles informations structurales sur le récepteur seul et des complexes associant des protéines mutantes iii) obtenir des informations cinétiques sur la réaction de transfert d'hème entre l'hémophore et le récepteur iv) obtenir des informations structurales sur la protéine HasB et son interaction avec le récepteur et la modulation de ces interactions par l'hémophore. L'ensemble de ces informations, couplé à des études de dynamique moléculaire devrait apporter des éléments de réponse sur les changements conformationnels se produisan