Développement des micropuces à protéines à haute performance pour l'analyse du phosphoprotéome et la recherche de médicaments contre le cancer – PhosphoProteomeArray

Le rôle des protéines impliquées dans les voies de signalisation et leurs réseaux d'interactions sont loin d'être actuellement bien compris dans la carcinogenèse. La technologie des micropuces à protéines et à anticorps ouvre une nouvelle voie pour l'étude comparative et quantitative d'un très grand nombre d'échantillons déposés sous la forme de micro-spots. Le premier objectif de ce projet est le développement et la commercialisation de puces à anticorps originales, ciblant le phosphoprotéome humain. Nous porterons une attention particulière aux conséquences du « blocage » de certaines protéines kinases, sur les voies de signalisation impliquées dans le cancer du sein et la leucémie. Cette approche nous permettra de mettre en évidence le rôle de ces nouveaux outils dans l'évaluation précoce des effets bénéfiques ou des effets secondaires d'agents thérapeutiques potentiels. Le deuxième objectif de ce projet est d'appliquer la technologie des puces à protéines à la recherche de nouveaux agents thérapeutiques en ciblant à haut débit des inhibiteurs de la dimérisation des protéines ErbB appartenant à la famille des récepteurs des tyrosine kinases. Les petites molécules inhibitrices sélectionnées devraient nous permettre de repérer et d'évaluer, en aval des voies de signalisation, l'impact des taux de phosphorylation et ses conséquences thérapeutiques dans le retard du développement des cellules du cancer du sein. //Ce projet est destiné à concevoir et à mettre sur le marché deux micropuces, originales et inexistantes à ce jour, pour la recherche sur le cancer. La première se propose d'analyser les protéines impliquées dans la réparation de l'ADN et les voies de signalisation apparentées, la seconde appréhendera un ensemble de protéines engagées dans les voies de signalisation et de régulation, dont le dysfonctionnement est impliqué dans le développement de tumeurs. Ces approches seront rendues possibles grâce à deux innovations technologiques, un nouveau support 3D et des nanocristaux fluorescents dans le visible et dans l'UV. Ces nouveaux outils renforceront les performances des puces à anticorps. De plus, nous développerons une nouvelle méthode de criblage des inhibiteurs de dimérisation des protéines sur la base de micropuces auto-assemblées. En effet, notre système permettra de détecter l'effet inhibiteur des petites molécules, en amont du processus de dimérisation, lors du décrochage du polypeptide natif des ribosomes. Cette approche nous permettra de sélectionner un nouveau type d'inhibiteur dirigé contre la famille des récepteurs ErbB. Nous envisageons d'identifier des petites molécules à haute affinité, efficaces dans le traitement du cancer du sein. Nous sommes persuadés que la mise à disposition de nos micropuces à anticorps et à protéines autoassemblées aura un fort impact dans le développement de nouveaux agents thérapeutiques.//Le Coordinateur (ProtNeteomix SAS) est spécialisé dans la fabrication des puces à protéines et à anticorps et des puces à petites molécules pour le criblage des chimiothéques et leurs applications pour la recherche sur le cancer. Le Coordinateur a déjà démontré sa maturité par le lancement en 2006 d'une puce à anticorps, MAGYarray. Le Partenaire 2 (Université de Nantes) développe des micropuces à protéines pour des applications biomédicales; ses principales activités concernent les interactions protéines-protéines, la réparation de l'ADN et les voies de signalisation dans les cancers. Le Partenaire 3 ( Université de Reims Champagne-Ardenne), un des pionniers de la nano-biotechnologie, développe des nouveaux types de sondes afin d'améliorer la détection par fluorescence dans les applications médicales. Le Partenaire 4 (Université de Tours) est spécialisé dans les récepteurs biologiques et les voies de signalisation.//WP1: Nous allons fabriquer deux micropuces à anticorps à haute performance. Nous étudierons les aspects qualitatifs et quantitatifs de l'analyse du phosphoprotéome du cancer du sein et de la leucémie. Différents paramètres seront optimisés pour améliorer la performance de la détection.
Milestones :
M1. Développer des micropuces à anticorps « DNA repair phosphoproteome »
M2. Améliorer la performance du support d¿immobilisation
M3. Développer les nanocristaux et leurs conjugués biologiques de haute qualité
M4. Développer des micropuces à anticorps « Signaling phosphoproteome »
M5. Evaluer la sensibilité, la dynamique, la spécificité et la reproductibilité des puces à anticorps
Délivrables :
D1: Le prototype des micropuces à anticorps « DNA repair phosphoproteome »
D2: La liste des anticorps sélectionnés pour les micropuces « Signaling phosphoproteome »
D3: Les nanocristaux et leurs conjugués pour les puces à anticorps
D4: Le prototype des micropuces à anticorps « Signaling phosphoproteome »
D5: Les critères qualitatifs et quantitatifs de l¿évaluation des micropuces à anticorps
Alternatives :
Dans le cas d¿un retard pour l¿obtention d¿un support d'immobilisation ou de nanocristaux, les micropuces à anticorps seront préparées sur nitrocellulose et la détection sera réalisée par des fluorophores organiques visible et dans l'infra-rouge proche.
WP2: Intégration des séquences codantes des domaines extracellulaires et tyrosine-kinase des protéines ErbB dans une puce à protéines autoassemblées. Choix des inhibiteurs potentiels à petites molécules par criblage virtuel. Evaluation de la spécificité et de l'efficacité des inhibiteurs sélectionnés, après le traitement des cellules du cancer du sein, avec des micropuces à anticorps.
Milestones :
M6. Identifier par criblage virtuel des petites molécules qui interagissent à l¿interface de dimérisation des protéines ErbB
M7. Développer des nanocristaux conjugués pour une détection plus performante
M8. Développer des puces à protéines auto-assemblées pour le criblage des inhibiteurs de dimérisation protéique
M9. Sélectionner des inhibiteurs de dimérisation des récepteurs ErbB
M10. Caractérisation quantitative des paramètres d'inhibition des molécules inhibitrices sélectionnées
M11. Evaluation des meilleurs candidats par les puces à anticorps
Délivrables :
D6. Liste des petites molécules interagissant à l¿interface de dimérisation des protéines ErbB
D7. Nanocristaux conjugués à 4 couleurs
D8. Puces à protéines auto-assemblées pour le criblage des inhibiteurs
D9. Liste des inhibiteurs de dimerisation des recepteurs ErbB
D10. Phosphorylation des protéines dans les cellules du cancer du sein traitées avec les inhibiteurs sélectionnés
D11. Liste des meilleurs candidats pour le développement d'un nouveau médicament anticancéreux
Alternatives : Des aptamères inhibiteurs seront créés pour tester le screening et développer des voies qui ciblent le domaine extracellulaire de ErbB.//L'Université de Nantes a concédé la licence exclusive et mondiale à ProtNeteomix sur les deux brevets concernant les méthodes de la synthèse des protéines et la fabrication des puces à protéines avec la détection par fluorescence dans l'infrarouge proche (développée par le partenaire 3). De plus, l'Université de Reims détient les droits de PI sur les nano-cristaux et discute la cession d'une licence portant sur le domaine des puces à anticorps à ProtNeteomix. Par ailleurs, il n'est pas exclu d'avoir recours à certains anticorps, propriété d'autres sociétés, pour les inclure dans le kit prototype.
Des discussions avancées se sont engagées entre les partenaires pour évaluer la répartition des retombées
économiques du projet. Dans le cas de dépôt de brevets, les partenaires sont d'accord pour que ProtNeteomix en soit propriétaire et reverse aux différents partenaires publics des redevances qui dépendront de l'importance de chaque technologie utilisée et revendiquée dans le dit brevet.