Technologies de FRET en temps résolu et récepteurs de la famille HER: analyse des phosphoryations et dimérisations – Dim-HER

L'objectif de ce projet est la mise à la disposition des médecins, de la communauté scientifique et de l'industrie
pharmaceutique de moyens analytiques pour suivre ou adapter les candidats médicaments ou la conduite
thérapeutique en cancérologie. De part leur implication dans diverses voies de signalisation conduisant à des
réponses biologiques telles la différenciation, la prolifération, l'invasion, ou encore l'angiogenése, les récepteurs de
facteurs de croissance à activité tyrosine kinase sont des cibles thérapeutiques privilégiées. Des molécules anti-HER2
ou anti-récepteur à l'EGF ont à l'heure actuelle obtenu une autorisation de mise sur le marché et sont utilisées dans les
traitements de divers cancers. Si la surexpression de la protéine HER2 dans les cancers du sein permet dans une
majorité des cas de prédire le succès de la thérapie ciblée, il n'en est pas de même pour l'EGFR. Compte tenu de leur
coût, de leur association croissante avec la radiothérapie ou d'autres chimiothérapies et de l'étude clinique de leur
utilisation dans d'autres localisations, la mise en place de biomarqueurs pour les thérapies anti-HER prend toute son
importance. Nous utiliserons notre technologie de transfert d'énergie en temps résolu (TR-FRET/HTRF®) et
développerons le multiplexage pour la mise en place de tests de diagnostic analysant le statut d'activation des
récepteurs HER: phosphorylation et dimérisation.//L'innovation technologique réside dans l'utilisation de la fluorescence et du transfert d'énergie en temps résolu
multiplexé comme moyen d'étude du statut d'activation des récepteurs de la famille HER. Notre technologie HTRF®,
robuste et quantitative peut par ailleurs être miniaturisée, ce qui permet d'envisager son utilisation pour des analyses à
partir de faibles quantités de matériel (biopsies, coupes en paraffine). Notre savoir faire permet de projeter la création
de formats d'essais compatibles avec des lecteurs de fluorescence microplaque et de s'affranchir d'approches telles
l'immunoprécipitation ou encore le FACS couplé au FRET. L'innovation biologique repose sur le statut d'activation des récepteurs HER dans le domaine des biomarqueurs. L'analyse des phosphorylations et/ou dimérisations est réalisée dans les laboratoires traditionnels de recherche, mais il n'existe pas à ce jour de solutions " prêtes à l'emploi". Seule la société Monogram Biosciences est à ce jour engagée dans cette voie avec sa technologie eTag®. Leur approche technologique fait cependant appel à une étape limitante d'électrophorèse capillaire pour séparer et quantifier les tags fluorescents signant les interactions protéiques ou les phosphorylations. Nous souhaitons à travers ce projet conforter notre avance technologique en fluorescence en temps résolu et notre positionnement dans le domaine du diagnostic médical en cancérologie. Ainsi que fournir a l'industrie des outils pour le HTS.//CISBio est un leader européen en radioimmunologie et développe des technologies pour l'industrie pharmaceutique. CISBio et le CRLC collaborent dans le domaine des marqueurs tumoraux. Depuis 2001 ils sont engagés dans un partenariat
scientifique et technique autour d' approches basées sur la technologie HTRF® pour l'analyse d'altérations
moléculaires impliquées dans le cancer. Sur l'axe radioimmunothérapie, des interactions existent entre l'INSERM U860 ( "Immunociblage et Radiobiologie en Oncologie" située sur le site du CRLC) et CISBio. Dans le cadre du présent projet, nous mettrons en commun notre expertise dans le domaine analytique, la chimie de conjugaison et les tests de diagnostic; le recrutement et le savoir-faire du CRLC dans le domaine des marqueurs tumoraux et de la gestion des thérapies ciblées; les compétences de l' U 860 dans la production de modèles in vitro et l'immunociblage in vivo des récepteurs HER.//1- Les étapes
*Mise en place des outils nécessaires au développement technologique. En particulier, l'U860 sélectionnera ou
produira les modèles cellulaires qui serviront de démonstrateurs. Ce laboratoire réalisera également les modèles de
tumeurs in vivo chez la souris. CISBio développera de nouveaux anticorps anti-HER et optimisera les couples Donneur-Accepteur compatibles avec un FRET multiplexé et réalisera les marquages des differents anticorps.
Le CRLC en collaboration avec l'U860 réalisera sur les modèles développés l'analyse de l'activation des
récepteurs HER par les méthodes classiques (FACS, immunoprécipitation, immunohistochimie).
*Mise en place la technologie de FRET multiplexé à partir des modèles in vitro et in vivo sélectionnés. Le CRLC
assurera la mise en place de la méthodologie et démontrera la faisabilité de l'approche développée. L'U860
sélectionnera les anticorps et CISBio mettra au point puis transfèrera au CRLC l'immunohistochimie résolue dans le
temps.
*Application de l'approche méthodologique à des prélèvements de patients issus du CRLC et collectionnés. Developpement des outils associés et du kit. Le CRLC assurera la logistique des prélèvements et l' analyse des activations par la technologie développée. En particulier, le protocole de traitement des tissus sera mis en place. Le positionnement de l'activation des récepteurs de la famille HER en tant que biomarqueur sera étudié au niveau du pronostic, de la stratification des patients et de la réponse aux thérapies ciblées.

2-Phasage
*Fin 2008, nous devons avoir sélectionné les paires de fluorophores pour multiplexage et/ou avoir validé l'alternative
brevetée. C'est une étape clef mais dont les risques sont maîtrisés compte tenu de résultats préliminaires obtenus.
L'expertise des équipes engagées dans le projet devrait permettre l'obtention des modèles biologiques et la
génération d'anticorps propriétaires sans obstacle majeur.
*Courant 2008-2009, la technologie proprement dite devra être mise en place et validée sur les modèles biologiques. Des
essais HTRF® seront disponibles pour la mesure des phosphorylations et dimérisations des récepteurs HER. Il conviendra d'apprécier la généralité de l'obstacle à surmonter, en particulier, la sensibilité et la spécificité des essais développés devront positionner favorablement les tests diagnostiques proposés par rapport aux techniques déjà disponibles. Dans ce but, les essais seront réalisés sur deux types de matériel : lysats de cellules ou coupes en paraffines. Deux type de mesures seront comparées : FRET en format microplaque et imagerie.
*En 2009-2010, la validation de la technologie dans le contexte clinique est réalisée. Le CRLC met en oeuvre des thérapies
anti-HER dans le cadre des indications des AMM et dispose d'une tumorothèque documentée et d'une large collection de tumeurs inclues en paraffine utilisables pour le projet.//D'un point de vue technologique, nous possédons une totale liberté d'exploitation de la technologie HTRF® (plus de 10
familles de brevets). Nous avons la licence exclusive de nouveaux fluorophores dans le proche infrarouge. A ce stade,
les perspectives de liberté d'exploitation des technologies que nous devons mettre au point pour ce projet semblent
très favorables.
Concernant l'application biologique, seule la société Aclara Biosciences a, à notre connaissance, déposé des
demandes de brevets sur l'application de leur technologie eTag® à l'analyse de l'activation des récepteurs HER en tant
que biomarqueur dans divers types de cancers. Cependant, il existe plusieurs publications antérieures à ces
demandes et le statut des brevets est à étudier et suivre plus précisément au cours de ce projet.
La répartition de la propriété industrielle du projet sera régie par un contrat de collaboration en cours de rédaction entre
CISBio, l'INSERM U860 et le CRLC.