Anatmie moléculaire et caractérisation physiologique de la synapse à ruban des cellules sensorielles auditives – Octosynapse

L'otoferline, protéine à domaines C2 impliquée dans une surdité récessive, est probablement le « senseur » calcique de la synapse à ruban des cellules sensorielles auditives, les cellules ciliées internes (CCI). Cette synapse libère le neurotransmetteur d'une manière particulièrement rapide et soutenue. Nous remplacerons par knock-in, dans les CCI de souris, l'otoferline par la synaptotagmine I (Syt I). L'analyse fonctionnelle des CCI de ces souris déterminera dans quelle mesure Syt I est capable de restaurer l'exocytose synaptique, perdue chez les mutants déficients en otoferline. Nous étudierons les propriétés biochimiques des six domaines C2 de l'otoferline et identifierons les acides aminés essentiels pour la liaison au Ca2+ et aux phospholipides. Nous déterminerons le rôle de KIF3a et de RIM, deux autres protéines synaptiques, par la caractérisation de souris knock-out. Nous définirons morphologiquement les deux pools vésiculaires fonctionnels (RRP et SRP) de la synapse des CCI.//La libération du neurotransmetteur par la synapse à ruban des cellules ciliée internes (CCI) est particulièrement rapide et soutenue, suggérant un mécanisme d'approvisionnement rapide des vésicules synaptiques. Les mécanismes à l'origine des propriétés particulières de cette synapse sont inconnus.
Pour aborder cette question, nous emploierons deux stratégies.
1) Progresser dans la compréhension de la fonction de l'otoferline, une protéine à domaines C2, défectueuse dans une forme de surdité humaine, et dont nous avons monté qu'elle est probablement le principal « senseur » calcique de la synapse des CCI. Nous générerons des souris «knock-in », dans lesquelles nous remplacerons l'otoferline par la synaptotagmine I (Syt I), le senseur calcique des synapses du SNC. Une analyse fonctionnelle des synapses des CCI de ces souris sera effectuée. Nous étudierons également les propriétés biochimiques des différents domaines C2 de l'otoferline, et tenterons d'identifier par mutagénèse les acides aminés essentiels pour la liaison au calcium et aux phospholipides.
2) Produire et analyser des souris défectueuses pour deux autres protéines synaptiques, RIM et KIF3a, dans les CCI. Leur analyse contribuera également à la compréhension du fonctionnement de la synapse de ces cellules.

L'équipe 1 a une expertise en neurogénétique moléculaire, biologie cellulaire, biophysique et physiologie des cellules sensorielles auditives. Elle a identifié la première synaptopathie auditive, par atteinte du gène de l'otoferline. L'équipe 2 a développé une nouvelle technique d'étude de l'ultrastructure des synapses du SNC, basée sur la congélation rapide à haute pression et la tomographie en microscopie électronique, ce qui permet d'obtenir une résolution sans précédent (4 nm). Avec l'appui d'un financement de l'ANR, les approches neurogénétique et neuroanatomique des deux équipes seront combinées pour étudier le fonctionnement particulier de la synapse des CCI.
//1. L'analyse de souris knock-in dont les CCI expriment la synaptotagmine I en remplacement de l'otoferline, renforcera notre hypothèse d'un rôle de senseur calcique pour l'otoferline.
2. Production in vitro des domaines C2 de l'otoferline.
3. Identification des domaines C2 de l'otoferline qui lient le Ca2+ ou les phospholipides, ainsi que des acides aminés impliqués dans ces interactions.
4 . Fonction de l'otoferline dans les autres cellules sensorielles de l'oreille.
5. Cinétique des vésicules synaptiques dans les CCI, grâce au développement de nouveaux outils d'imagerie in vivo.
6. Connaissance des molécules motrices impliquées dans le trafic des vésicules synaptiques des CCI.
7. Rôles de KIF3a et de RIM dans la synapse des CCI.
8. Définition morphologique des pools de vésicules synaptiques de la CCI qui ont été établis fonctionnellement (Ready Releasable Pool et Slowly Releasable Pool).