Nouvelles méthodes d'analyse locale par FCS : dynamique membranaire de cellules tumorales – LocalFCS

Au début des années 70, des chercheurs américains ont proposé une nouvelle technique de spectroscopie basée sur une analyse statistique temporelle de l'émission de molécules fluorescentes en solution : la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Les fluctuations de fluorescence observées sont reliées au nombre moyen de molécules dans le volume d'observation ainsi qu'à leur temps de diffusion. Les applications de cette technique sont multiples. On peut étudier par exemple la mobilité de biomolécules, les interactions moléculaires, ou encore suivre des modifications de conformation. Néanmoins, jusqu'ici les conditions nécessaires à la mise en œuvre de la FCS sont très restrictives, la limitant par exemple à des milieux ultra purs biomimétiques, ce qui exclut de fait les études in vivo. Dans ce projet, nous nous proposons de développer une technique optique permettant de dépasser ces limites, de manière à s'intéresser par la suite à des systèmes réels. A travers une collaboration forte avec un groupe de biophysiciens, la jeune équipe Nanobiophotonique du LNIO dédiera ces progrès expérimentaux à l'étude de la dynamique de la membrane plasmique de cellules tumorales. Pour cela, nous analyserons la diffusion membranaire de cellules vivantes en combinant la FCS avec une technique de microscopie originale et novatrice, qui se démarque de manière pertinente des approches actuelles proposées par la communauté FCS. Cette dernière vise à réduire considérablement le volume sondé via une excitation indirecte très localisée par transfert d'énergie, permettant ainsi de s'affranchir efficacement de la forte inhomogénéité de la membrane plasmique. Cette mise en application originale de la FCS nous permettra d'analyser un grand nombre de mécanismes biologiques caractérisés par des modifications de la cohésion de la structure membranaire des cellules.
Ce projet de recherche repose sur une collaboration étroite entre l'équipe porteuse de physiciens, basée à l'UTT, et une équipe de biophysiciens, localisée à l'URCA. Il s'agit d'un projet fortement ancré à l'interface de la biologie et de la physique instrumentale, s'inscrivant dans la problématique intercommunautaire de l'avancement des connaissances vers des échelles de plus en plus petites. - - Le développement instrumental que nous proposons s'articule autour de l'association de la FCS avec la microscopie en champ proche optique. Cette dernière permet de visualiser des signaux optiques spatialement très confinés à l'aide d'une sonde de taille nanométrique. Le but recherché dans le cadre de ce projet est de produire une nano-source de lumière permettant ainsi de faire de la FCS dans un volume nanométrique (de l'ordre, voire inférieur à l'attolitre). Le schéma que nous proposons est le suivant : l'excitation de l'échantillon ne se fera pas directement à l'aide d'un faisceau laser, mais via un transfert d'énergie non-radiatif de type Förster, connu sous son acronyme anglais FRET (Förster Resonance Energy Transfer). En raison de la portée nanométrique du transfert d'énergie, ce choix original d'illumination FRET ouvre la possibilité de détecter des espèces chimiques avec une très grande résolution spatiale, encore jamais approchée en FCS, ce qui permettra l'analyse fine de la dynamique membranaire. - Nous nous proposons ensuite d'utiliser les capacités originales de notre montage pour l'étude d'échantillons d'intérêt biologique. Dans le domaine de la recherche sur le cancer, la résistance à la chimiothérapie est principalement liée à des processus biochimiques membranaires. Les interactions entre le médicament et la membrane plasmique mettent en jeu des mécanismes particuliers. Ces derniers peuvent se traduire par une modification de la fluidité, de la perméabilité de la membrane, mais aussi par l'apparition de micro-domaines (rafts, caveolae) ou de protéines d'expression du rejet. Dans ce projet,