– RF-MTase

La méthylation des protéines est une modification post-traductionnelle très courante et très conservée de la bactérie à l'homme. Lorsqu'elle se fait sur des atomes d'azote, elle est souvent impliquée dans des processus de régulation tels que la modulation de l'expression des gènes via la modification des histones. Ce processus est également fondamental au niveau de la traduction, puisque la méthylation de certaines protéines ribosomiques semble essentielle à la biogenèse du ribosome. Les facteurs de terminaison de classe I (RF1, RF2 chez E. coli, et eRF1 chez S. cerevisiae) sont méthylés sur la glutamine de l'unique motif conservé GGQ. Ce motif se trouve dans le centre peptidyl-transférase du ribosome et stimule l'hydrolyse du peptidyl-tRNA. En absence de ribosome, eRF1 est compléxé à eRF3, facteur de terminaison de classe II, dont le rôle n'est actuellement pas aussi bien défini que son homologue bactérien, impliqué dans le recyclage de RF1 et RF2. Chez S. cerevisiae, la méthylation de eRF1 est catalysée par une methyltransférase composée de deux sous-unités, Ydr140w et Ynr046w, et nécessite la présence de eRF3 et de GTP. La délétion du gène Ydr140w affecte enormément la croissance cellulaire. Mes objectifs sont de clarifier la fonction de cette méthyltransférase chez la levure en étudiant son rôle potentiel dans divers processus liés à la traduction. Dans cet objectif, nous voulons étudier: (i) le mécanisme de méthylation de eRF1 (ii) le rôle de la méthylation de eRF1 dans l'efficacité de terminaison de la traduction (iii) le rôle de la méthylation de eRF1 dans le processus de NMD (Nonsense-mediated mRNA Decay) 1. Mécanisme de méthylation de eRF1: Ydr140w méthyle eRF1, mais seulement en présence de la protéine Ynr046w, qui appartient à une famille de protéines encore non caractérisées. Afin d'appréhender le mécanisme de la méthylation ainsi que le rôle de Ynr046w, la résolution de la structure tridimensionnelle du complexe Ydr140w.Ynr046w sera un atout majeur. Cette étude sera réalisée en collaboration avec le groupe de H. van Tilbeurgh (Université Paris Sud). Une approche fonctionnelle de la méthylation chez l'archaebactérie Halobacterium salinarum, où il ne semble pas exister d'analogue de eRF3, mais des analogues de Ydr140w et Ynr046w, sera également menée. 2. Rôle de la méthylation de eRF1 dans l'efficacité de terminaison: Des expériences préliminaires montrent que l'absence de méthylation de eRF1 a un effet négatif sur la terminaison in vivo chez S. cerevisiae. De nouvelles expériences sont nécessaires pour savoir si l'effet de la méthylation de eRF1 est le même à tous les codons stop ou si la methylation a pour conséquence de moduler l'efficacité de terminaison de certaines protéines. Ces expériences seront réalisées en collaboration avec le groupe de JP Rousset (Université Paris Sud) qui possède les bons outils permettant de mesurer l'efficacité de terminaison in vivo. Nous testerons également si la méthylation de eRF1 peut avoir un rôle dans les étapes post-terminaison, à savoir un rôle dans les intéractions du complexe de terminaison avec la protéine de liaison à la queue poly(A) des ARNm (Pab1p). 3. Rôle potentiel de la méthylation de eRF1 dans le processus de NMD: La NMD (Nonsense-mediated mRNA Decay) est un mécanisme eucaryote qui permet de dégrader les ARNm contenant un codon stop précoce. Ce processus est intimement lié à la terminaison de la traduction puisqu'il y a interaction entre les facteurs de terminaison, les facteurs Upfp effecteurs de la NMD et la protéine Pab1p. Afin d'étudier s'il existe un lien entre l'état de méthylation de eRF1 et la stabilité d'ARNm non sens, deux types d'expériences seront réalisés :(i) une étude de la stabilité des ARNm dans un mutant ydr140w, les mutants upf et les doubles mutants ydr140w/upf. (ii) des expériences d'immunoprécipitation visant à étudier les conséquences de la méthylation sur l'intéraction de eRF3 avec les facteurs Upfp. Ces études devraient permettre de mieux comprendre le mécanisme de méthylation de eRF1 et en particulier la fonction de l'hétérodimère Ydr140w.Ynr046w. D'une façon plus générale, nous abordons le rôle physiologique d'une protéine methyltransférase dans des processus complexes vitaux comme la terminaison de la traduction et la stabilité des ARNm.