MyD88, un nouveau médiateur de la transformation par Ras – MyD88

Projet : MyD88, un médiateur de la transformation par Ras. - - I. Préambule - - Le système immunitaire inné reconnaît un nombre limité de motifs microbiens très conservés chez les microbes par des récepteurs conservés au cours de l'évolution, en particulier les TLRs. MyD88 est une molécule adaptatrice qui permet le recrutement de molécules de signalisation aux TLRs - Nous avons montré que les souris déficientes en MyD88 sont résistantes aux tumeurs, ainsi que les fibroblastes qui en sont dérivés. - - II. Plan expérimental - - II-1. Le rôle de MyD88 dans la cascade de signalisation par Ras. - Nous avons démontré que l'activation de la voie RAS/MAPK mesurée par la phosphorylation de ERK après traitement des MEFs avec du FGF est compromise en l'absence de MyD88. De façon intéressante, MyD88 contient un motif d'interaction avec ERK (RRRLSLFL) fortement conservé entre les espèces, et qui pourrait médier une interaction entre ces deux protéines. Nous allons tester cette hypothèse par des expériences de co-immunoprécipitation ou de co-sédimentation (GST-pulldown) avec des constructions codant pour la séquence sauvage de MyD88 ou pour des formes mutées dans le domaine d'interaction avec ERK. - - - II-2. Les conséquences de l'inactivation de MyD88 in vitro et in vivo. - - II-2-1. In vitro - Nous avons sélectionné plusieurs séquences de siRNA (www.ambion.com) pour lequelles nous avons démontré la spécificité pour MyD88. La transfection de ces séquences de siRNA dans des lignées cellulaires humaines entraîne un blocage du cycle cellulaire au niveau de la transition G1/S. Nous étudierons plus précisément les bases moléculaires de ce blocage en mesurant les niveaux d'expression et le statut fonctionnel de différentes molécules impliquées dans la régulation du cycle cellulaire, tels que c-Myc, les cyclines, etc. - - II-2-2. In vivo - II-2-2-1. Génération de vecteurs lentiviraux. - Pour s'affranchir des limitations des siRNA classiques en termes de stabilité et de capacité à cibler les cellules, nous allons générer un siRNA spécifique de MyD88 et un siRNA contrôle dans des vecteurs lentiviraux. - - II-2-2-2. Infection et analyse de souris développant des tumeurs dépendantes de Ras. - Nous utiliserons un modèle murin de tumeurs sporadiques développé dans le laboratoire de T. Jacks (MIT, Cambridge, MA.), qui a l'avantage de reproduire la nature sporadique de nombreux cancers humains. La cinétique d'apparition des tumeurs sera évaluée en comparant les souris infectées avec le siRNA MyD88 et le siRNA contrôle. Après autopsie, les tissus tumoraux seront analysés afin d'évaluer l'expression de MyD88, les marqueurs de prolifération (ex : PCNA) et l'apoptose (TUNEL). - - II-3. Le statut du gène et de la protéine MyD88 dans des échantillons de cancers humains. - - Nous allons effectuer des analyses par western blot sur un grand nombre de tumeurs du poumon et leurs tissus adjacents pour quantifier le niveau d'expression de la protéine dans chacun d'eux. Ensuite, nous séquencerons le gène MyD88 (les 5 exons) pour chacun des échantillons tumoraux et péri-tumoraux. Nous quantifierons aussi le niveau d'expression de l'ARN de MyD88 par qRT-PCR. - - - III. Retombées potentielles - - L'étude de MyD88 constitue un domaine entièrement nouveau. L'implication de ce gène dans les cancers n'a pas été systématiquement étudiée jusqu'à présent. Les expériences chez les souris MyD88 -/- suggèrent que la perte de ce gène entraîne un phénotype de résistance tumorale, hautement original. A notre connaissance, ce phénomène n'a pas été identifié pour d'autres gènes connus. Il est donc possible que notre projet débouche sur un nouvel ensemble de mécanismes de résistance et/ou de susceptibilité tumorale. De plus, Sachant que MyD88 n'est pas nécessaire au développement et à la survie des cellules normales de l'organisme, nos résultats montrant un arrêt de la division cellulaire dans les cellules cancéreuses traitées avec un inhibiteur de MyD