Oxydation de l'ADN, mécanisme moléculaire d'oxydation des guanines et application à la détection et la qualification des lésions qui en résu – DNAOX

L’intégrité chimique de l’ADN est extrêmement importante pour la vie. En conséquence il est très résistant à l’hydrolyse mais malheureusement, il est sensible à l’oxydation. Le phénomène de stress oxydant est responsable de nombreuses pathologies humaines ou de processus de dégénérescence. De plus il est maintenant communément admis que des lésions générées par oxydation de l’ADN sont impliquées dans le vieillissement, la mutagenèse, la carcinogenèse et la mort cellulaire. Les radiations ionisantes ont pour principal effet l’oxydation de l’ADN. Les dommages d’ADN par oxydation constituent donc un souci majeur dans des conditions de stress oxydant. Les bases guanines sont les sites privilégiés d’oxydation de l’ADN. Ce sont les cibles préférentielles des réactions de transfert d’électron, elles sont également modifiées par les radicaux hydroxyles. Un certain nombre de produits d’oxydation de la guanine ont été caractérisés in vitro au niveau moléculaire. Cependant il est possible que toutes les lésions n’aient pas encore été décrites et leur valeur prédictive en termes de viabilité cellulaire pose encore des questions. Un intermédiaire clé dans la formation des produits d’oxydation de la guanine est le radical-cation de guanine. Ce projet va s’intéresser à deux aspects du radical-cation (i) son devenir dans une cellule (quelles lésions sont prévisibles) et (ii) la maîtrise de sa réactivité pour concevoir des sondes moléculaires pour le quantifier. Tout d’abord, la considération des différentes voies possibles de dégradation du radical-cation de guanine montre que la formation de nouvelles lésions pourrait être envisagée. Ce projet s’attachera à l’isolement et la caractérisation structurale de nouvelles lésions de l’ADN issues du radical-cation de guanine et ceci dans des conditions expérimentales essayant de mimer au mieux les situations in vivo. En particulier, l’étude des dommages sur l’ADN réalisée en absence d’anion superoxide permettra à certaines réactions de devenir cinétiquement possible. En effet, les études précédentes visant à isoler les produits d’oxydation de la guanine étaient biaisées par la présence de ce piégeur de radicaux très puissant (l’anion superoxyde). Il est possible que cette réaction pratiquement exclusive ne soit pas révélatrice de ce qui se passe in vivo ou du moins qu’elle ait empêché la détection d’autres produits éventuellement observables in vivo. Ce projet a pour but de réétudier les réactions d’oxydation de la guanine à l’aide de nouvelles conditions expérimentales et d’un nouveau test capable de déceler tout type de lésion par l’analyse d’oligonucléotides par spectrométrie de masse. Cela conduira à une meilleure connaissance des dommages engendrés sur l’ADN par oxydation et orientera les recherches futures de ces dommages in vivo. En deuxième lieu, la connaissance des mécanismes réactionnels impliqués dans le devenir du radical-cation de guanine nous a conduit à concevoir un test in vitro pour quantifier sa formation. En effet, il a été découvert récemment que le radical-cation de guanine, qui est à l’origine de la plupart des produits d’oxydation de la guanine, pouvait être piégé non seulement par une molécule d’eau (comme dans le cas de la formation de 8-oxo-G) mais aussi par d’autres nucléophiles comme des groupements amines. Lorsque des amines sont associées à l’ADN en contre ions des groupements phosphates, une réaction extrêmement rapide entre l’amine et le radical-cation de guanine conduit à un adduit covalent entre l’amine et l’ADN. Cette réaction peut entrer en compétition avec le piégeage du radical-cation par l’anion superoxide. En conséquence, des amines seront utilisées pour réagir avec le radical-cation de guanine et ainsi le révéler. Dans des conditions expérimentales appropriées, qui devront être définies, cette réaction devrait s’avérer stoechiométrique et devrait permettre une quantification du radical-cation. Ce test donnera une possibilité de « screening » de molécules ou d