Thérapie génique de la porphyrie érythropoïétique congénitale – GENETHERCEP

Le but général du projet est le transfert de gènes à visée thérapeutique dans les cellules souches hématopoïétiques. Il concerne un modèle murin de porphyrie érythropoïétique congénitale (PEC) obtenu récemment au laboratoire. La PEC est une maladie récessive autosomique caractérisée par un déficit en uroporphyrinogène III synthase, la quatriéme enzyme de la biosynthèse de l'hème. La sévérité de la maladie (lésions cutanées mutilantes et anémie hémolytique nécessitant des transfusions régulières) et l'absence de traitement spécifique en dehors de la greffe de moelle osseuse sont des arguments forts en faveur du développement d'une thérapie génique. La correction par transfert lentiviral des cellules souches/progénitrices déficientes humaines et l'expression du transgène dans les érythroblastes devrait considérablement améliorer le pronostic. Nous nous proposons donc de développer un protocole préclinique de la maladie grâce à notre modèle animal.*******************La stratégie consiste en une greffe des cellules médullaires murines génétiquement modifiées exprimant l'enzyme déficiente. Le vecteur aura subi plusieurs améliorations afin de limiter le risque d' oncogenèse insertionnelle: i) utilisation de vecteurs lentiviraux SIN, ii) suppression des promoteurs viraux, iii) utilisation d'un promoteur tissu-spécifique, iv) insertion éventuelle de séquences insulatrices. Les cellules souches hématopoïétiques (Sca1+ Lin- ou bien EPCR+) seront transduites ex vivo à l'aide des vecteurs lentiviraux et réimplantées chez les souris receveuses. Ces dernières recevront différentes doses de busulfan comme conditionnement, pour se rapprocher des conditions d'un protocole clinique. L'efficacité du transfert de gènes (pourcentage de cellules transduites) et le niveau d' expression du transgène seront évalués à long terme dans les différents tissus hématopoïétiques. La correction du phénotype porphyrique sera déterminée par l'étude de l'accumulation des porphyrines et la disparition de la photosensibilité cutanée. Pour répondre à la question importante de la présence (ou non) d' un avantage sélectif, différents mélanges de cellules normales et porphyriques (10 à 100% de cellules normales)seront injectés aux souris porphyriques. L'évolution des 2 populations cellulaires (porphyriques et normales) sera suivie au cours du temps. Ces expériences seront réalisées en parallèle avec celles des cellules déficientes transduites (thérapie génique). Dans le même temps, le modèle de la souris « humanisée » sera utilisé pour suivre le devenir des cellules souches hématopoïétiques humaines : des cellules CD34+ déficientes (natives et génétiquement modifiées) seront injectées à des souris immunodéficientes NOD/SCID afin d' analyser la population des cellules greffées. S'il n'y a pas d'avantage sélectif des cellules normales ou déficientes corrigées, nous utiliserons un vecteur bicistronique coexprimant le gène thérapeutique et le système de sélection MGMT.*******************Ce projet a pour but de mettre au point un protocole de transfert de gène dans les cellules souches hématopoïétiques en vue d'une thérapie génique de la PEC. La prise de greffe des cellules génétiquement modifiées en présence d'un conditionnement partiel des souris est souhaitable. Le point le plus important pour le succès du protocole clinique est la présence (ou non) d'un avantage sélectif. Si une sélection spontanée des cellules normales ou déficientes corrigées a lieu in vivo dans le modèle murin, il est raisonnable de penser que celle-ci sera aussi présente chez l'homme. Nous pourrons alors proposer un protocole clinique utilisant un vecteur simple et un conditionnement non myéloablatif comme cela est déja réalisé pour la maladie SCID-ADA. Notre expérience acquise grâce à ce modèle nous permettra d'élargir notre recherche vers d'autres pathologies hématologiques, en particulier d'autre anémies hémolytiques et les hémopathies.