Le RNome, Targetome et Régulome des petits ARN de bacteries à Gram positif et négatif – G+G-sRNAs

Le rôle des petits ARN (ARNp) a été découvert récemment. Chez les bactéries, ils ont entre 60 et 500 nucléotides, ne codent pas des protéines pour la plupart et sont induits dans des conditions spécifiques. La majorité des ARNp s'apparie avec des ARN messagers (ARNp) pour moduler leur stabilité et/ou leur traduction; il en résulte une activation ou répression des voies ciblées. Les ARNp sont impliqués dans de nombreux processus comme la réplication, les régulations transcriptionnelles et traductionnelles ou la dégradation et la translocation des protéines. Chez E. coli, l'existence de ~80 ARNp a été démontrée ; cependant, la plupart de leurs cibles sont inconnues et donc leurs fonctions restent à découvrir. Chez le Staphylocoque doré, hormis l'ARNIII et une étude pionnière du laboratoire de Felden révélant 12 ARNp, peu est connu sur les ARNp. La découverte d'ARNp et de leurs cibles révélera l'existence de nouveaux réseaux de régulation dépendants d'interactions ARN/ARN multiples.
Le projet proposé est une étude globale des petits ARN (RNome), de leurs cibles (targetome) et de leurs régulations (régulome) chez le Staphylocoque doré et Escherichia coli. Nous caractériserons le RNome du Staphylocoque doré; nous considérons que celui d' E. coli est presque complet. Nous avons récemment développé une méthode pour identifier des cibles ARN messagers (ARNm) de n'importe quel petit ARN régulateur (ARNp) ; elle nous a permis d'identifier les cibles de deux nouveaux ARNp exprimés par E. coli. Pour les deux organismes étudiés, nous réaliserons une identification globale des cibles des ARNp en utilisant cette nouvelle méthode. A cette fin, des puces ADN pangénomiques de E. coli (disponible) et de S. aureus (à développer) représentatives de toutes les ORF et de régions intergéniques d'intérêts seront utilisées. Les cibles identifiées seront validées in vivo en utilisant des souches ou les ARNp étudiés seront absents ou surproduits. L'expression des ARNp sera étudiée par une batterie de tests (milieux de croissance, stress biotiques et antibiotiques) afin d'identifier les conditions physiologiques qui permettent la modulation des messagers cibles. Les appariements entre ARNp et leurs cibles suggérés par des analyses bio-informatiques seront examinés in vitro et confirmés par des expériences de mutagenèse dirigée. Le rôle des protéines Hfq ou pseudo-Hfq vis-à-vis des interactions de ARNp-ARNm sera examiné en solution par l'utilisation de sondes structurales. Ce projet produira de nombreuses données expérimentales comprenant l'identification de nouveaux ARNp, les conditions de leur expression et leurs cibles ARNm. Ceci nous permettra de sélectionner les ARNp qui auront des cibles identifiées comme ayant un rôle dans des fonctions essentielles ou dans la virulence bactérienne. Des études structurales détaillées seront réalisées sur ces ARNp qui seront des cibles putatives pour des composés antibactériens.
Ce travail permettra l'identification de nouveaux ARNp chez S. aureus et des cibles ARN messagers (ARNm) chez S. aureus et E. coli. Des réseaux de régulations basés sur des interactions de ARN/ARN seront identifiés chez ces deux principaux pathogènes humains, élucidant ainsi la fonctionnalité de leur RNome. Les types de régulations et les protéines associés à l'activité des ARNp seront comparés entre les deux espèces bactériennes; cette étude mettra en évidence les différences entre bactéries Gram positives et négatives. Le RNome bactérien peut vraisemblablement être employé en tant qu'outil diagnostique. Nos études structurales sur les ARNp affectant des fonctions essentielles ou de virulence pourront contribuer au développement de molécules antibactériennes. Ce travail servira de base conceptuelle à de futures études impliquant d'autres pathogènes et aura d'importantes applications tant en microbiologie fondamentale qu