Etudes structurales et fonctionnelles du complexe de la polymérase du virus de la grippe (PA,PB1 et PB2) et identification des partenaires cellulaires chez les oiseaux et les mammifères. – FLU INTERPOL

Nous étudierons la structure et de la fonction de la machinerie de réplication et de transcription du virus de la grippe. Ces processus ont lieu sur de grands complexes formés d'ARN et de protéines (ARN viral, nucléoprotéine (1 nucléoprotéine toutes les 24 bases) et une copie du complexe trimérique de polymérase (PB1, PB2 et PA)). Pour palier aux problèmes d'expression de ces protéines, nous utiliserons une nouvelle technique de clonage et d'expression à haut débit automatisée par l'EMBL (ESPRIT). Deux domaines solubles de la sous-unité PB2 du complexe de polymérase ont déjà été produits, la structure de l'un d'entre eux a été déterminée par RMN. De même, nous produirons, exprimerons et cristalliserons tous les domaines des 3 polymérases, de la NP et de NS1. Nous rechercherons ensuite par technique de double hybride les protéines cellulaires qui interagissent avec ces domaines dans des banques ORféome humain, de poulet et de souris.
Notre programme de recherche s'articule autour de trois axes :
1. La détermination des domaines solubles de ces protéines sera poursuivie et nous déterminerons leur structure par cristallographie aux rayons X ou par RMN en collaboration avec des scientifiques de l'EMBL et/ou de l'IBS.
2. Nous examinerons les activités biologiques des différents domaines produits. En particulier, nous examinerons la fonction du domaine de PB2 qui est responsable de la liaison à la coiffe de l'ARN messager; du domaine de PB1 qui est responsable de la liaison aux extrémités 3' et 5' de l'ARN viral et nous regarderons également si PB1 possède une activité résiduelle de polymérisation lorsqu'on lui fournit un ARN matrice et une amorce; de même nous étudierons la fixation des domaines solubles de la nucléoprotéine à l'ARN, en comparaison de nos travaux précédents portant sur la fixation de l'ARN à la nucléoprotéine intacte. Nous développerons des essais pour le criblage d'inhibiteurs comme complément pour la conception de nouveaux médicaments basés sur la structure tridimensionnelle de protéines.
3. Les interactions entre les domaines viraux et les protéines cellulaires d'homme et de poulet seront identifiés par la technologie double-hybride en levure à haut débit. Cela permettra de comprendre comment les différents domaines se connectent sur le réseau d'interaction protéique selon leur variabilité génétique et l'origine de la cellule (spécificité d'espèce). En parallèle de l'identification des partenaires cellulaires de ces protéines virales, nous ferons une analyse bioinformatique de la perturbation du réseau d'interaction des protéines cellulaires par les protéines virales et développerons des tests biologiques pour corréler les données d'interactions aux conséquences fonctionnelles des interactions identifiées.
De façon pragmatique, ce programme permettra d'identifier les facteurs cellulaires (en terme d'interactions) favorisant la réplication virale ou la virulence.
La connaissance des structures tridimensionnelles des trois sous-unités de la polymérase du virus de la grippe et de la nucléoprotéine du virus de la grippe nous permettra de développer des essais pour le criblage d'inhibiteurs comme complément pour la conception de nouveaux médicaments basés sur la structure tridimensionnelle de protéines.
L'analyse des interactions entre les domaines viraux et les protéines cellulaires d'homme et de poulet nous permettra de comprendre comment les différents domaines se connectent sur le réseau d'interaction protéique selon leur variabilité génétique et l'origine de la cellule (spécificité d'espèce).