Microsystèmes et microélectrochimie intégrés pour l'étude physicochimique d'évènements biologiques uniques résolus spatialement et temporellement. – mPHYSCHEMBIO

Nous proposons de développer dans le projet suivant une série de cinq méthodologies électrochimiques, innovantes et complémentaires, dédiées à l'étude d'évènements biologiques uniques dans leur environnement cellulaire. A la différence des stratégies proposées actuellement en Biologie Moléculaire et en Biophysique, celles que nous mettrons en œuvre consisteront à associer de façon unique différentes techniques analytiques pour suivre la dynamique rapide de flux infinitésimaux de messagers chimiques libérés par une cellule unique, tout en conservant l'intégrité des caractéristiques spatiales et temporelles. En effet, l'activité des nano-objets biologiques au sein de l'environnement cellulaire s'effectue selon des processus biochimiques contrôlés par des mécanismes au niveau de structures de dimension micrométrique (vésicules, membranes...). Bien que les techniques de spectroscopie à champ proche ou électrophysiologiques se soient avérées essentielles dans l'approfondissement de nos connaissances des systèmes du vivant (en « visualisant » certaines de leurs caractéristiques spatiales et temporelles), elles n'atteignent cependant pas la résolution analytique et cinétique des mesures ampérométriques sur ultramicroélectrode (synapse artificielle). A l'opposé, les méthodes électrochimiques ne peuvent donner directement d'informations sur les caractéristiques topologiques du système biologique. Elles demeurent de plus « aveugles » aux évènements impliquant des molécules faiblement diffusantes (protéines) ou faiblement électroactives. Cependant, les techniques de microfabrication permettent dorénavant d'envisager le couplage de ces deux approches pour tirer bénéfice des avantages liés à chacune d'entre elles. Une première série de deux stratégies étudiera la possibilité de détecter et de quantifier par voie électrochimique avec une précision cinétique adéquate (de l'ordre de la milliseconde) des flux impliquant des molécules diffusant lentement ou étant de faible électroactivité. Ces stratégies sont axées sur l'intégration d'ultramicroélectrodes couplées dans des systèmes de type microfluidique. Celles-ci seront utilisées en mode de détection générateur-collecteur ou leur couplage sera employé pour générer localement de l'électrochimiluminescence. Ces deux approches sont ambitieuses mais leurs résultats potentiels devraient apporter une contribution significative à une large gamme d'applications. Nous voulons aussi étudier trois autres stratégies qui permettront de résoudre des problématiques majeures liées à la perte d'information topologique en microélectrochimie. Nos études porteront sur un processus biologique essentiel, l'exocytose de neuromédiateurs, et seront conduites sur le modèle des cellules chromaffines libérant des espèces électroactives (catécholamines) et non-électroactives (polypeptides) après stimulation. La sécrétion par exocytose implique des vésicules sub-micrométriques fusionnant avec la membrane cellulaire et libérant ainsi leur contenu en information biologique dans le milieu extracellulaire vers des cellules cibles. Une première stratégie dans ce contexte consiste à adapter la technique de microscopie électrochimique à balayage (SECM) pour identifier avec précision les zones de libération des messagers sur la surface des cellules. L'utilisation d'ultramicroélectrodes de taille nanométrique devrait offrir une résolution spatiale élevée tout en suivant leur cinétique spécifique de sécrétion. Finalement, deux autres stratégies couplées consisteront à associer des mesures, soit par microscopie de fluorescence, soit par spectroscopie d'impédance, (patch-clamp) avec des mesures précises de flux de molécules messagers par des ultramicroélectrodes. La première implique l'utilisation de microélectrodes transparentes (ITO) qui permettront de réaliser in situ et en temps réel le couplage fluorescence / électrochimie. La seconde revient à associer microélectrochimie et mesures électrophysiologiques. La fusion de vésicules