ARNs non-codant (ncARNs) impliqués dans la virulence de Listeria monocytogenes – ncARNs

L'importance des ARNs non codants (ncARNs) dans la régulation de la transcription, la stabilisation des ARNs et le contrôle de la traduction est largement reconnue chez les eucaryotes et les procaryotes. Les ncARNs sont souvent codés par les séquences intergéniques. Ce projet a pour but l'identification et la caractérisation de la structure et du mode d'action des ncARNs chez la bactérie pathogène Listeria monocytogenes. Notre but est de découvrir de nouveaux mécanismes de régulation contrôlant la virulence et/ou d'autres propriétés de Listeria, qui pourraient être spécifiques de Listeria ou de portée plus générale. Ce projet comporte deux phases:
1- L'identification et la caractérisation de ncARNs impliqués dans la virulence de L. monocytogenes:
Les ncARNs seront recherchés par des approches in silico suivies d'une validation expérimentale soit par analyse par Northern blot, soit par hybridation directe des ARNs totaux à des membranes portant les séquences intergéniques, ou par hybridation après co-immunoprécipitation des ncRNAs à l'aide d'anticorps dirigés contre la protéine Hfq, une protéine connue pour se fixer sur les ncARNs. L'expression des ncARNs et leur régulation seront étudiées in vitro ainsi que dans des conditions d'infection. La structuration secondaire des ncRNAs sera analysée in silico et déterminée en utilisant des approches biochimiques. La détermination de la structure tridimensionnelle de ces ARNs pourra ensuite être entreprise.
Afin d'identifier les ncRNAs spécifiquement impliqués dans la virulence, les gènes codant les ncARNs identifiés seront surexprimés ou inactivés chez Listeria et les phénotypes des souches correspondantes analysés in vitro, lors d'infections de cellules en culture, ou dans différents modèles animaux.
2- L'analyse du mode d'action des ncARNs
L'identification de cibles ARNs potentielles (ARNs ou proteines) sera réalisée par une analyse in silico. La validation de ces cibles sera réalisée par l'analyse de l'effet de la surexpression ou de l'inactivation des gènes codant les ncARNs sur l'expression des cibles potentielles. En cas d'échec de l'analyse in silico, la recherche sera réalisée en analysant le transcriptome et le protéome de souches surexprimant ou inactivées pour le gène codant le ncRNA. Les interactions ARNs/cibles seront caractérisées par l'identification des régions essentielles à leurs appariements à l'aide d'approches génétiques ou biochimiques.
Les cibles protéiques seront recherchées in silico, et par des techniques de chromatographie d'affinité. Les régions nécessaires à l'interaction seront analysées à l'aide d'approches génétiques ou biochimiques.
L'analyse des complexes ncARNs/ARNs ou ncARN/protéines sera entreprise par co-cristallographie.
Afin d'identifier les gènes et cascades de régulations contrôlés par les ncARNs, l'analyse transcriptomique et protéomique des souches surexprimant le ncARN ou déletées pour le gène correspondant, seront analysées in extenso.