Genotoxic and biological tracers for integrated micronucleus assay in living cells – GENOTRACE

Le développement de l’essai MN intègre différentes technologies. (i) De petits anticorps reconnaissant la chromatine sont utilisés comme biotraceur de génotoxicité. En effet, exprimés dans les cellules avec une étiquette fluorescente, ils permettent de visualiser la chromatine, et donc les chromosomes, dans les cellules vivantes et en temps réel. Après insertion de ce biotraceur dans les cellules hépatiques métaboliquement compétentes (ii), l’essai MN a été adapté en plaque 96-­--puits pour de l’évaluation à moyen débit (iii). Des protocoles d’imagerie à haut contenu informatif associés à l’utilisation d’outils d’analyse d''image ont également été mis en oeuvre (iv). Ainsi ce projet tend à la caractérisation, in vitro et en temps réel, du potentiel génotoxique des substances/contaminants. Il renseigne sur les processus induisant l’instabilité génétique (composés clastogènes et/ou aneugènes) et pourra être utilisé dans la prévention et le diagnostic d’exposition à des génotoxiques, afin de protéger notre environnement et notre santé

Le biotraceur de génotoxicité a été inséré dans les cellules hépatiques métaboliquement compétentes. Après traitement avec différents composés génotoxiques de référence, nous observons la présence de micronoyaux avec un effet dose-­--réponse. Après traitement avec l’Aflatoxine B1, dont le pouvoir génotoxique dépend de la métabolisation cellulaire, nous obtenons également un essai micronoyau positif, démontrant les capacités métaboliques des cellules utilisées. Après un marquage des centromères, le mécanisme clastogène et/ou aneugène de formation des micronoyaux peut être analysé (voir illustration)

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Le brevet (N° 13 55941) concernant le biotraceur de génotoxicité, publié en décembre 2014, a été étendu à l’international en janvier 2016. Les partenaires 1 et 2 ont également publié un article scientifique présentant cet outil (Jullien et al. 2016). Une publication concernant l’essai micronoyau et regroupant les trois partenaires est en préparation et sera prochainement soumise (fin 2018). Ces travaux ont également été présentés, sous forme de posters, lors de différents congrès internationaux.

Among the short-term tests developed to assess the mutagenicity, genotoxicity or carcinogenicity potency of chemical compounds, the micronucleus (MN) assay is largely recognized as a reliable and precise method for detecting chromosome damage. The MN assay is indeed a multi-target genotoxic endpoint, allowing the assessment of clastogenic and aneugenic events. The assay is amenable for automation and allows good extrapolation for potential limits of exposure, with easy measurement in both in vitro and in vivo experimental systems. However, classical MN assay does not provide a dynamic assessment. We propose to bring innovation in the field of tests for hazard and risk assessment of potential mutagens/carcinogens by developing a new in vitro MN assay.
The GENOTRACE public/private consortium aims at monitoring the production of chromosome damage in real time, recording in parallel the transcription signal of a genotoxic stress response reporter. To achieve this aim, the project takes advantage of biotracers newly developed by Partners 1 & 2, first to label the nucleus by expressing a chromobody directed against the H2A-H2B histone complex, allowing to visualize chromatin dynamics in real-time, second to follow the DNA Damage Response (DDR) activation by expression of a p21 regulatory dependent reporter. Thus, a positive MN assay associated with either a positive or negative DDR signal will give insights regarding the MN origin, induced by clastogenic or aneugenic mechanisms respectively. These biotracers will be stably expressed into HepaRG metabolically active cells, optimized for MN assay by Partner 3, and the developed in vitro MN assay will be adapted to a medium- to high throughput straightforward readable assay, thanks to the implementation of high content screening imaging protocols and the development of an image analysis and classification-based pipeline. Overall, as our project will allow to determine and classify the genotoxic potential of substances/contaminants in vitro, and in real time, it will bring new capacity to classic genotoxic assays and may lead to progress in the prevention and/or the diagnosis of exposure to genotoxicants.