Control of the Expression of the “AFL” REgulatory network and Seed development – CERES

L’une des raisons expliquant le manque de données sur le régulation du réseau AFL dans la graine réside dans la petite taille et la faible accessibilité de cet organe. La méthode de choix pour caractériser in vivo le statut chromatinien, les modifications des histones ou les activités de liaison à l’ADN est l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP).

Le projet est basé sur une adaptation de ces techniques pour les appliquer à la graine en cours de développement. Des méthodes d’étiquetage des protéines d’intérêt (protéines chimériques) seront menées, tout en gardant la fonctionnalité des protéines modifiées.

La validation fonctionnelle des régulateurs/régulations sera effectuée dans des systèmes d’expression (levure, protoplastes de mousse) ou in planta, en utilisant les outils de la génétique classique et des mutants disponibles.

En parallèle une analyse de l’expression des AFLs, de leurs cibles et de leurs régulateurs sera menée, par l’étude de l’accumulation des transcrits correspondant et de l’activité des promoteurs correspondant.

Le projet se déroule normalement et les résultats les plus marquants ne sont attendus qu’à la fin du programme.

Nous avons cependant déjà pu mettre en évidence et caractériser une première régulation de type chromatinienne sur le promoteur du gène LEC2 et identifier une séquence régulatrice dans le promoteur de LEC2 qui est responsable de son inactivation en dehors de la graine en développement.

Ceci permet de mieux comprendre pourquoi ce gène ne peut pas être réactivé facilement dans les parties végétatives (pour faire accumuler des réserves dans des feuilles par exemple) car son expression est lié à un « état » de différenciation du tissu végétal (graine vs feuille) et pas seulement à la fixation spécifique d’un simple activateur transcriptionnel qui serait alors plus facile de manipuler.

La compréhension des régulations du réseau AFL pourrait permettre de modifier les graines de plantes cultivées par des approches classiques ou « biotechnologiques ».

Au delà de ce réseau, le développement de nouveaux outils pour l’étude de la chromatine et des interactions protéines/ADN dans la graine ouvrira la voie à des analyses exhaustives de ses cibles « in planta » et pourra être utilisé pour l’étude d’autres réseaux plus spécifiques (accumulation des lipides, des protéines de réserve ou de métabolites secondaires).

Par ailleurs ce projet devrait contribuer une meilleure compréhension des mécanismes de différenciation cellulaire, ce qui pourra avoir des impacts pour l’amélioration des plantes.

1- Berger N., Dubreucq B., Roudier F., Dubos C., and Lepiniec L. (2011). Transcriptional regulation of Arabidopsis LEAFY COTYLEDON2 involves RLE, a cis-element that regulates trimethylation of histone H3 at Lys-27. Plant Cell. , 23, 11 4065-4078.
Cet article décrit la régulation de LEC2, un des AFLs, et la façon dont ce gène est réprimé dans les organes végétatifs par un mécanisme chromatinien lié à la modification post-traductionnelle d’histones positionnés au niveau du promoteur de LEC2.

2- Berger N and Dubreucq B. (2012). Evolution goes GAGA : GAGA binding proteins across kingdoms. BBA gene regulatory mechanisms, 1819, 863-868.
Cet article est une revue montrant les similarités de certains mécanismes de régulation entre le monde animal et le monde végétal.

Post-translational modifications of histones and DNA methylation by chromatin remodelling enzymes and DNA methylases represent the basis of the epigenome of a cell which changes throughout development to modulate gene expression. In plants, chromatin remodelling has been shown to play a crucial role in developmental phase transitions (for example at fertilisation and flowering) by establishing and maintaining at mitosis specific expression patterns required to fulfil the defined developmental programme. Although there is compelling evidence that epigenetic programming plays an essential role at seed germination, only scarce and scattered information on the existence of such a higher degree of regulation during seed development is available. The onset and execution of the seed maturation phase is controlled principally by four master regulatory genes, ABI3, FUS3, LEC1 and LEC2 (collectively named “AFL”). Due to their key role in seed maturation, it is essential for the plant to suppress their expression during germination and vegetative growth. Genetic analyses have demonstrated the involvement of different regulators in the strong repression of AFL gene expression in vegetative tissues, such as histone modification proteins (e.g. HDA6 and 9), Polycomb-related proteins (e.g. MEA, CLF and SWN) and different subunits of chromatin remodeler complexes (e.g. PKL and BRM). These observations invite a complementary perspective: how is the seed maturation phase activated, maintained and then repressed during seed development?

The CERES project aims to address this question, firstly by providing insights as to how chromatin dynamics regulate the AFL network during seed development and secondly, to investigate whether AFL utilise chromatin remodelling to control the expression of their target genes. As a prerequisite, we will establish a precise spatio-temporal map of AFL gene expression together with a comprehensive description of the dynamics of the patterns of chromatin modifications at the AFL loci during seed development. Since AFL loci are under the repressive H3K27me3 marks during vegetative growth, we will compare the spatio-temporal maps obtained in wild type and in mutant lines deficient in histone modification activities associated with a loss of HAT, HDAC and JMJ proteins. Differences in patterns will identify putative regulators of the AFL network and/or their target genes. Given that AFL are thought to recruit chromatin remodelling enzymes at their target loci, the chromatin status will be assessed on a selection of target loci and the interaction between the putative chromatin regulators and seed transcription factors, including AFL, will be tested. In addition, the functionality of putative cis-elements present in the promoters of the 4 AFL genes will be established in order to subsequently identify new transcription factors regulating the AFL network and DNA sequences which maybe recognised by the chromatin regulators.

The CERES project is ambitious with respect to the biological questions, the number of genes whose function will be investigated, the development of new tools adapted to the small quantity of seed materials and the potential applications for crop improvement. Successful achievement of our objectives requires a robust partnership. The three partners have a history of collaboration, strong backgrounds in Arabidopsis functional genomics and complementary expertise in the study of gene regulation during seed development. We expect that the proposed study will reveal new insights into the relationships between the chromatin machinery and the control of gene expression during developmental transitions in seed that are tightly regulated at the spatial and temporal levels.